“Malo je poznato ali PCR aparat je ustvari ringla sa tajmerom na sebi.”, Imer Muhović, Twitter


Ima tih nekih stvari što se po školama ne uče, a, kako čujem, ostaju na vrlo opskurnom nivou razumijevanja i onima koji studiraju biologiju. 

 

 

PCR

Vi koji ste pratili C.S.I. (ok, ta serija je sad već prilično demode) ili Bones (ok, i ova serija je prošlost), možda ste naletili na termin PCR. Puno stvari u genetici zvuče čudno i nejasno, mnogo postupaka i tehnika djeluju kao magija, a PCR je jedna od tih tehnika čiji su principi tako razumljivi ljudima iz branše, a tako čudni svima ostalim.
 
PCR je termin koji se odnosi na tehniku umnožavanja DNK. Da vas podsjetim – DNK je neobična molekula sa mnogo neobičnih svojstava, a jedno od njih je da DNK može proizvesti samu sebe u procesu koji se naziva autoreplikacija/duplikacija. DNK se duplicira u S-fazi staničnog ciklusa i nakon duplikacije DNK hromosomi dobijaju dvije hromatide. Također, DNK funkcioniše kao neka vrsta otiska prsta svakog od nas i po DNK nas se može identificirati.

Vjerujem da to znate, dok čitate moj blog i da vam je jasno kako savremena kriminalistika i sudstvo koriste DNK otiske (DNA fingerprinting) za identifikaciju žrtava, počinilaca zločina, nestalih osoba i identifikaciju ljudi koji su bili na mjestu zločina. Svi mi ostavljamo neke biološke tragove –  perut, dlake, tjelesne izlučevine – i pažljivim prikupljanjem tih bioloških tragova, poštujući protokole prikupljanja kako ne bi došlo do kontaminacije, dobijaju se dokazi koji se mogu analizirati i na osnovu kojih se mogu donijeti neki zaključci.

Not so fast! Postoji jedan mali problem – DNK u uzorcima bude jako malo, nedovoljno za analizu, Zato se DNK mora umnožiti – DNK otisak se mora “podebljati”, “boldirati”. I za to nam treba PCR.

 

PCR je akronim za Polymerase Chain Reaction, proceduru koju je 1983. razvio nobelovac Kary Mullis, a koja suštinski predstavlja zagrijavanje i hlađenje uzorka izolirane DNK na određenim temperaturama – kada su temperature više, oko 94°C (do oko 98 °C ), lanci DNK se rastavljaju jer slabe hidrogenske veze između azotnih baza. Negdje ćete pročitati da se DNK “topi” ili denaturira – kako god, samo je bitno da znate da se pri zagrijavanju na ovim temperaturama ne uništavaju fosfodiesterske veze između dezoksiriboze i fosforne kiseline, nego samo hidrogenske veze između komplementarnih baza. Pri hlađenju DNK na temperature od oko 55-60 °C, hidrogenske veze se ponovo uspostavljaju.


Duplikacija DNK pomoću enzima

 

 
Međutim, ako u epruvete za PCR dodate još neke stvari, rastavljeni lanci se neće tek spojiti, nego će svaki sintetizirati sebi komplementaran lanac. Ako se dodaju još i prajmeri, enzim Taq polimeraza i slobodni nukleotidi, dodali ste repromaterijal za amplifikaciju DNK. Šta su ovi dodaci?
 
Prajmeri – male sekvence nukleotida (svega nekoliko nukleotida povezanih u lanac), koje su komplementarne dijelovima, počecima rastavljenih strana DNK tj. polulancima DNK. Kako nakon izlaganje jedne molekule DNK temperaturi > 94 °C postoje dva polulanca, tako na jednu molekulu DNK trebaju 2 prajmera. Oni se vežu za 3′ kraj DNK i zapravo služe kao neka vrsta vodiča, znakova za enzim polimerazu, pokazuju koje se to sekvence DNK amplificiraju jer se u PCR ne amplificira cijela molekula DNK, nego neke njene sekvence. Za ovo vezivanje je potrebno da se temperatura smjese snizi na oko 55° C.
 
DNK polimeraza – enzim koji slobodne nukleotide veže po principu komplementarnosti na polulance DNK
 
Taq polimeraza – DNK polimeraza otporna na ekstremne uslove u kojima se odvija PCR, tj, na uslove temperatura na kojoj se većina proteina denaturira, ireverzibilno mijenja i prestaje vršiti svoju biohemijsku ulogu. Enzimi su, proteini, pa se i na njih odnosi ovo pravilo. Međutim, postoje organizmi koji žive u vrelim izvorima te posjeduju termostabilnu DNK polimerazu. Takav organizma je termofilna bakterija Thermus aquaticus. Upravo se njena DNK polimeraza koristi za PCR. Za dodavanje komplementarnih strana polulancima, temperatura se programira na oko 62 -70°C – dakle malo se poveća u odnosu na temperaturu potrebnu da se prajmeri prikače na polulance, ali je niža od temperature na kojoj se polulanci rastavljaju.
 
Slobodni nukleotidi – dNTPs, dezoksinukleotid trifosfati – gradivne cigle DNK.
 
I da – za PCR trebaju još i puferski sistem, koji održava optimalnu pH vrijednost te neki dvovalentni joni, najčešće joni magnezijuma iz MgCl2, koji služe kao kofaktori Taq polimerazi.
 

Sama DNK sekvenca koja se umnožava predstavlja template, “šablon” amplifikacije. U PCR je bit ponavljanje zagrijavanja i hlađenja template sekvence – tj. rastavljanje ove sekvence, kako bi Taq polimeraza na rastavljene polulance mogla dodavati slobodne nukleotide koje istraživač dodaje u “recept”, u smjesu ovih različitih molekula. Ovi ciklusi zagrijavanja i hlađenja se moraju ponoviti više puta, a to zavisi od toga kakav je sam početni uzorak i u kakvu se svrhu DNK amplificira. Obično se radi 40-60 ciklusa amplifikacije, ali ih može biti i 20.

 

 
Molekule DNK koje nastanu u ovom procesu bi trebale biti identične šablonu, ali ponekad dođe do pojave mutacija, tzv. “PCR-induciranih mutacija”, naročito ako se umjesto magnezija koristi mangan.

Protokoli za PCR se mogu razlikovati u nijansama – u tačnim temperaturama, broju ciklusa, kofaktoru ili vrsti pufera te se, u ovisnosti od sekvence koja se želi amplificirati, razlikuju u prajmeru. PCR RNK sekvenci, recimo kada želimo dokazati postojanje nekog RNK virusa u uzorku se radi malo drugačije od prethodno opisanog PCR, pomoću enzima zvanih reverzne transkriptaze. Ali o tome drugi put.

Naravno, naučnici u laboratorijama ne zagrijavaju sami DNK, pa je hlade – danas za to postoje mašine, koje se programiraju da zagrijavaju i hlade uzorke na specifičnim temperaturama i koje se također programiraju na broj ciklusa: