Dr Anja Haverić, naučnica koja istražuje 3D ćelijske modele: “Važno je da nastavnici budu inspirativni”

Nauka govori: Kako 3D ćelijski modeli u biotehnologiji doprinose smanjenju potrebe za testiranjem na životinjama u biomedicinskim istraživanjima?

Dr Anja Haverić: Otkako je počela upotreba ćelijskih modela uopće u istraživanju, što se desilo sredinom 20. vijeka, došlo je do značajne redukcije u upotrebi životinja za različita istraživanja. U svakom slučaju, postojala je tehnika koja je omogućila opsežnija istraživanja sa puno manje etičkih dilema i tehnika koja je bila eliminatorna u smislu da su samo, ako na primjer govorimo o kontekstu razvoja lijekova, supstance sa poželjnim svojstvima dalje bile testirane in vivo na laboratorijskim životinjama.

Ipak, ti ćelijski modeli, sada poznati kao 2D ćelijski sistemi, imaju određena ograničenja kao što su nedostatak ćelijskih interakcija i kompleksnosti tkivnih struktura, zbog čega su moguće i razlike u efektima testiranih agenasa u 2D ćelijskim modelima i u živim sistemima. 3D modeli ćelija stvaraju trodimenzionalno okruženje koje bolje odražava in vivo uslove i prevazilaze navedene probleme 2D ćelijskih kultura. Oni preciznije imitiraju stvarne fiziološke uslove. Zbog navedenog, 3D ćelijski modeli su omogućili bolju i efikasniju primjenu 3R principa u testiranju na životinjama. 3R princip, nazvan prema tri engleske riječi: reduction, replacement i refinement, podrazumijeva maksimalno smanjenje broja životinja koje se koriste u istraživanjima, zamjenu upotrebe životinja alternativnim metodama kao što su ćelijske kulture i konačno, unaprjeđenje istraživanja u smislu smanjenja patnje životinja te prikupljanja maksimalne količine informacija iz minimalnog broja upotrijebljenih životinja.

Nauka govori: Kako se stvaraju ovi modeli, od kojih ćelija, da malo približimo čitaocima?

Dr Anja Haverić: 3D modeli ćelija se mogu kreirati od ćelija dobijenih iz različitih izvora. To mogu biti primarne ćelije direktno izolovane iz tkiva, indukovane pluripotentne matične ćelije reprogramirane iz odraslih ćelija ili uspostavljene ćelijske linije. Izbor tipa ćelije zavisi od specifičnog tkiva koje se modelira. Proces uključuje ugrađivanje ćelija u odgovarajuće potporne matrice, kao što su hidrogelovi ili tzv. skele, kako bi se rekreirala prirodna trodimenzionalna arhitektura. Istraživači manipulišu uslovima kulture kako bi podstakli ćelije da se samoorganizuju i oponašaju strukture i funkcije specifične za tkivo. Ovo može uključivati davanje odgovarajućih biohemijskih signala, kontrolu nivoa kiseonika ili prilagođavanje dostupnosti nutrijenata. Ovi dizajnirani 3D modeli ćelija mogu predstavljati različita tkiva iz različitih organa kao što su jetra, bubrezi, mozak i još mnogo toga.

Koje su prednosti korištenja 3D ćelijskih modela u odnosu na dvodimenzionalne modele u istraživanjima genotoksičnosti?

Dr Anja Haverić: Suštinu prednosti 3D ćelijskih modela sam ukratko spomenula, međutim, brojne su prednosti 3D ćelijskih modela i pored spomenute efikasnije i vjernije interakcije između ćelija uključuju: bolju interakciju ćelija i ekstracelularnog matriksa, bolju fiziološku relevantnost i prostorni aranžman što posljedično omogućava dobivanja reprezentativnijih rezultata i bolju preciznost predviđanja in vivo efekata što je posebno važno za razvoj novih lijekova i vakcina. Još jedna prednost 3D ćelijskih modela je što se mogu dugotrajno kultivirati bez bojazni da će doći do promjene kompletnog fiziološko-biohemijskog fenotipa ćelija kao što je rizik u 2D ćelijskim kulturama. Ovo svojstvo omogućava i istraživanje hronične izloženosti testnim agensima.

Međutim, moramo razumjeti i da 3D modeli imaju nekih ograničenja a to je da ne mogu, još uvijek, biti potpuna zamjena za in vivo studije, optimizacija i standardizacija protokola za 3D ćelijske kulture može biti izazovna i mala varijacija u uslovima kulture, izvorima ćelija ili tehnikama može utjecati na rezultate. Značajno ograničenje u odnosu na žive organizme je nedostatak imunog sistema i imunološkog odgovora, što u nekim istraživanjima može biti ključno.

 

Nauka govori: Kako se 3D ćelijski modeli koriste za simuliranje složenih mikrookruženja u tijelu i kako to utječe na njihovu primjenu u testiranju genotoksičnosti?

Dr Anja Haverić: 3D ćelijski modeli su dizajnirani da simuliraju složeno mikrookruženje unutar tijela inkorporirajući ključne karakteristike tkiva, kao što su interakcije između ćelija, sastav ekstracelularnog matriksa (op.a tekućina izvan ćelija, kojom su ćelije okružene) i tkivno specifična arhitektura. Ovo omogućava istraživačima da proučavaju genotoksične efekte odabranih agensa u fiziološki relevantnijem kontekstu, s obzirom na to kako susjedne ćelije utječu na međusobne odgovore na genotoksični stres. Za testiranje genotoksičnosti različitih agenasa, to znači razmatranje ranjivosti specifičnih za tkivo i odgovora na genotoksične agense, pružajući uvid u to kako različiti organi mogu reagirati na potencijalno oštećenje DNK.

Nauka govori: Koje vrste 3D ćelijskih modela su najčešće korištene u istraživanjima genotoksičnosti, i zašto?

Dr Anja Haverić: U principu, razlikuju se statički i dinamički 3D ćelijski modeli koji se razlikuju po svom pristupu. Statička ćelijska kultura je pristupačnija i standardizovanija metoda uzgoja stanica u fiksnom i stabilnom stanju, kao što je stacionarna posuda za kultivaciju dok dinamički pristup podrazumijeva upotrebu rotirajućih ili perfuzionih sistema.

U istraživanju genotoksičnosti koriste se različite vrste 3D modela ćelija, od kojih svaki nudi specifične prednosti. Uobičajeni 3D modeli ćelija uključuju:

1. Organoide – To su samoorganizirajuće strukture oponašaju arhitekturu organa i mogu biti izvedene iz različitih tkiva.
2. Sferoidi koji predstavljaju agregate ćelija koji formiraju sferične strukture, sferoidi su jednostavniji od organoida, ali i dalje nude prednosti u odnosu na tradicionalne 2D kulture.
3. Mikrotkiva – specifične konstrukcije koje se sastoje od više tipova ćelija raspoređenih u specifičnoj arhitekturi.
4. Bioprinted modeli – Koristeći tehnologiju 3D bioprintinga, istraživači mogu kreirati precizne 3D strukture sa prostornom kontrolom. Ovo omogućava razvoj složenih tkiva za ispitivanje genotoksičnosti, nudeći ponovljivost.
5. Mikrofluidne platforme koje omogućavaju proučavanje genotoksičnosti u dinamičkim uslovima, simulirajući protok tečnosti u tkivima i organima.

 

Izbor 3D ćelijskog modela ovisi o ciljevima istraživanja, tkivu od interesa i složenosti koja je potrebna za rješavanje specifičnih pitanja genotoksičnosti. Organoidi su, na primjer, poželjniji kada se želi replicirati složenost organa, dok bi jednostavniji modeli poput sferoida mogli biti prikladni za masovni skrining. Sve u svemu, raznolika lepeza 3D modela ćelija u istraživanju genotoksičnosti omogućava istraživačima da odaberu model koji je najbolje usklađen sa specifičnim ciljevima njihovog istraživanja.

 

Nauka govori: Kako se 3D bioprinting tehnologija primjenjuje u stvaranju 3D ćelijskih modela za testiranje genotoksičnosti?

Dr Anja Haverić: Tehnologija 3D bioprintinga koristi se u kreiranju 3D modela ćelija za ispitivanje genotoksičnosti kroz precizno i kontrolirano – sloj po sloj – taloženje stanica i biomaterijala. Proces započinje digitalnim dizajniranjem modela tkiva ili organa, definišući raspored ćelija i potporne matrice. U sljedećoj fazi se vrši odabir biomaterijala koji će služiti kao matrica a imaju visoku biokompatibilnost. Zatim se uvode ćelije kako bi se stvorila biotinta koja se stavlja u ketridž za bioprinter i slijedi printanje sloj po sloj prema dizajnu. Slijedi povezivanje i očvršćavanje te strukture kako bi bila stabilna. Bioštampana struktura zatim treba da se integriše u uslovima kulture i onda slijede različita testiranja uključujući testiranje genotoksičnosti. Brojne su prednosti 3D bioprintinga uključujući i stvaranje struktura koje su relavantnije za testiranje genotoksičnosti.

 

Nauka govori: Koje su najčešće metode evaluacije genotoksičnosti koje se koriste s 3D ćelijskim modelima, i kako se upoređuju s konvencionalnim metodama?

Dr Anja Haverić: Suštinski, metode koje se koriste u 2D i 3D ćelijskim modelima se puno ne razlikuju. Jedan od široko korištenih i visoko informativnih testova je komet test tj. gel elektroforeza pojedinačnih nukleoida, što su, u stvari, ostaci liziranih ćelija. Test je dobio naziv po karakterističnom izgledu ovih nukleoida na mikroskopu nakon bojenja. Naime nukleiodi sa izuzetno oštećenom DNK molekulom upravo izgledaju kao komete na kojima se može razlikovati glava, u kojoj se nalaze nedregadirani dijelovi DNK molekule, i rep, u kojem je oštećena DNK. Još jedan atraktivan test je mikronukleus test a zasniva se na detekciji mikronukleusa, odnosno ekstranuklearnih formacija genetičkog materijala, kao biomarkera DNK oštećenja. Primjenjuju se naravno i molekulske metode kao što su različita imunobojenja, testovi metaboličke i energetske aktivnosti, testovi za detekciju oksidativnog stresa ili ćelijske smrti, ekspresija gena i proteina, protočna citometrija. Odabir testa zavisi od opremljenosti laboratorije tj. dostupnosti opreme ali i o cilju samog istraživanja, naravno.

Nauka govori: Kako se 3D ćelijski modeli mogu prilagoditi specifičnim potrebama istraživanja genotoksičnosti, kao što su različite vrste tkiva i ekspozicija različitim hemikalijama?

Dr Anja Haverić: Sve vrste in vitro istraživanja podrazumijevaju strogo kontrolisanje uslova u smislu odabira odgovarajuće kulture uključujući i odgovarajuću kontrolnu kulturu, sastava hranjivog medija, temperature, koncentracije CO₂ s jedne strane, odnosno koncentracije testnog agensa i dužine izloženosti kada su u pitanju varijable vezane za testni agens.

Ono što je specifično za 3D ćelijske modele je da je potrebna jedna temeljita optimizacija i karakterizacija uspostavljenjog 3D ćelijskog modela kako bi interpretacija rezultata istraživanja genotoksičnosti bila adekvatna.

 

Nauka govori: Kakva je istorija istraživanja i rada na 3D ćelijskim modelima u BiH? Da li je nešto rađeno prije ovoga?

Dr Anja Haverić: Iako su inicijalni pokušaji za dugoročno kultiviranje ćelija u vještačkim uslovima vezani još za 19. vijek, intenziviranje upotrebe 3D ćelijskih modela je vezano za kraj 20. i početak 21. vijeka, dakle ne tako davno. Koliko je meni poznato, pojedini istraživači iz BiH su učestvovali u kolaborativnim istraživanjima na 3D ćelijskim modelima ali mislim da opsežnija istraživanja u BiH nisu još rađena. Nadam se da ćemo u Institutu uskoro intenzivirati istraživanja i na statičkim i na dinamičkim 3D modelima.

 

Nauka govori: Ko sve čini vaš tim u projektima „3D ćelijski modeli – alternativa testiranju na životinjama“, (2024-2025) UNSA-Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, finansijer Federalno ministarstvo obrazovanja i nauku i „Testiranje genotoksičnosti odabranih hemikalija i farmaceutika na 3D ćelijskim modelima (GENTOX3D)“?

Dr Anja Haverić: Od zemalja u našoj blizini, Slovenija je lider u 3D ćelijskim kulturama. Mi smo, mislim na Institut, ponosni na već dugogodišnji sporazum o saradnji sa Nacionalnim institutom za biologiju iz Ljubljane a evo, posljednjih 5 godina i na sve intenzivniju saradnju sa timom profesorice Bojane Žegure koja vodi Odjel za genetičku toksikologiju i biologiju kancera, i intenzivno se bavi 3D ćelijskim modelima, posebno ćelijama kancera jetre. S obzirom da navedeni projekat osim istraživačkog dijela, podrazumijeva i transfer znanja, nije bilo dileme da tim ovog projekta čini ukupni tim profesorice Bojane (doktori nauka Matjaž Novak, Alja Štern, Martina Štampar i Katja Kološa) kao i tim Laboratorije za citogenetiku i genotoksikologiju UNSA-INGEB-a u kojem su pored mene još doktori nauka Sanin Haverić i Maida Hadžić Omanović te magistrice Tamara Ćetković Pećar i Irma Durmišević.

Dr Anja Haverić: Kako je došlo do ove saradnje sa Slovenijom te u sklopu kojih inicijativa su projekti podržani?

Dr Anja Haverić: Kao što rekoh neka načelna saradnja sa Nacionalnim institutom za biologiju iz Ljubljane postoji već dugih niz godina i povremeno su realizovane izvjesne studijske posjete NIB-u. Međutim, saradnja tima Laboratorije za citogenetiku i genotoksikologiju sa timom profesorice Bojane je praktično vezana za 2017-2018. godinu kada smo se mi priključili hCOMET COST akciji. Ova COST akcija je imala za cilj standardizaciju protokola za primjenu komet testa u biomonitoring studijama ljudskih populacija. Od tada smo planirali i prijavljivali zajedničke projekte na različite grantove. Moram reći da je budžet GENTOX3D projekta daleko najveći i ostvaren je kroz Javni poziv Ministarstva za nauku, visoko obrazovanje i mlade Kantona Sarajevo u 2023. godini. Kao simbolični dodatak ovom projektu dobili smo od Federalnog ministarstva za obrazovanje i nauku projekat bilateralne saradnje između Slovenije i BiH i kroz taj projekat je obezbijeđen dio sredstava za putne troškove kojim će se omogućiti dodatno usavršavanje i povezivanje naših istraživača. I ne smijem zaboraviti individualnu aplikaciju naše kolegice Irme Durmišević na Western Balkan Move Grant i ostvarenje mogućnosti da provede mjesec dana na treningu u Sloveniji a potom da rezultate svog rada predstavi i prodiskutuje sa kolegama u Srbiji.

Nauka govori: Koliko su važne ovakve suradnje finansiranja projekata?

Dr Anja Haverić: Koliko god mi bili sretni kada neki naučni rezultat postignemo isključivo vlastitim kapacitetima i naporima, mislim da je izuzetno važno iskoristiti prilike koje pruža saradnja. Osim što to ponekad znači lakši i brži put do implemeniranja nekih novih znanja i iskustava to isto tako znači i drugu perspektivu onoga čime se bavimo što zasigurno poboljšava i kvalitet samih istraživača i kvalitet njihovog rada i finalnog produkta njihovog rada što je obično naučni rad. Ponekad čak i samo publiciranje takvog rada zahtijeva značajna finansijska izdvajanja a kroz kolaborativne studije pristupi čak i fondovima za tu namjenu mogu biti lakši. Dodatno, svakako bolje reference i bolje kompetencije svih istraživača predstavljaju uslov za pristup određenim grantovima bilo na nacionalnom ili internacionalnom nivou. I ono što svakako treba istaknuti da svaki projekat nije u stvari zatvorena knjiga nego otvara neke nove ideje, nove mogućnosti, omogućava odlazak na međunarodne konferencije koje također mogu biti visoko inspirativne i rezultirati važnim kolaboracijama. Sada je generalno aktuelan princip otvorenosti u svim segmentima nauke i definitivno ga treba primjenjivati jer praksa je pokazala da isključivo donosi benefite.

Nauka govori: Kako privući još novca za naučno-istraživačke projekte u BiH?

Dr Anja Haverić: Ja moram pohvaliti pothvat koji je posljednih godina napravilo Ministarstvo za nauku, visoko obrazovanje i mlade te značajno povećanje izdvajanja za programe za nauku. Ilustracije radi, jedan moj projekat je ovo ministarstvo 2019. godine sufinansiralo u iznosu od 6.000,00 KM dok mi je prošle godine za GENTOX3D projekat odobren iznos od 82.000,00 KM. Moram priznati da ovo još nije nivo izdvajanja kojem se teži kroz dugoročnu strategiju za razvoj nauke ali je signifikantno povećanje. U BiH su istraživačima dostupni i neki drugi javni pozivi i grantovi, sa različitim očekivanim procentom uspješnosti i različitim budžetima, koje svakako treba budno pratiti i nastojati zadovoljiti tražene propozicije. Istraživačima iz BiH su dostupni i neki međunarodni grantovi. Na žalost, Bosna i Hercegovina još uvijek ne može u punom kapacitetu aplicirati na neke EU fondove tj. ne može biti glavni aplikant ali kroz kolaboracije je moguće da učestvuje kao partner tako da i te mogućnosti treba koristiti. U svakom slučaju, pisanje projekata i upravljanje istim je svakako poseban izazov za istraživače a uspješnost poboljšavaju bolje kompetencije, saradnja i inovativnost.

Nauka govori: Kako privući mlade u STEM – i zadržati ih u BiH, odnosno, ako odu na studije vani i na specijalizacije – kako im omogućiti povratak i pružiti zdravu sredinu za nastavak karijere?

Dr Anja Haverić: Svakako je izazov za politike ali i za univerzitete i institute činjenica da veliki broj mladih ljudi trajno odlazi iz zemlje. Evidentna je pojava da se svake godine sve manje brucoša upisuje na fakultete u BiH pri čemu je još jedna otežavajuća okolnost činjenica da postoji veliki broj fakulteta i da je, da tako kažem, borba za svakog studenta. S druge strane, svjedoci smo da veliki broj mladih ljudi relativno lako dolazi do neke popularnosti i zarade putem društvenih mreža a rad u nauci nije baš tako lagan i potrebno je kontinuirano dokazivanje i sebi i drugima. Iz tog razloga, rekla bih da je zaista potrebno uložiti značajne napore da se nauka uopće učini atraktivnom i da bude prvi izbor mladim nadama. Mislim da je za to ključna jedna vertikalna sinhronizacija od osnovne škole do najviših akademskih nivoa. Mislim da je važno da nastavnici i srednjoškolski profesori u STEM oblastima budu dovoljno inspirativni i da stimulišu mlade ljude da se bave ovim oblastima. Mislim da treba polako razbijati te mitove o teškim predmetima i garantovano lošem uspjehu iz istih. Ja zato iskreno vjerujem da je posao svakog pedagoškog radnika u obrazovanju izuzetno važan i da prije svega trebaju nastojati da proizvode sretne generacije i generacije koje nemaju strah od nauke kao teške i predodređene za odabrane. Dodatno mislim da je svakako važno stimulisati mlade ljude koji su svoje školovanje završili u inostranstvu a izrazili su želju da se vrate, da to i postignu.

 

Članak je napravljen kao dio projekta WB6